HILIC-tips, deel 5 Zouten correct afstellen voor de mobiele HILIC-fase

De toevoeging van zout aan de mobiele HILIC-fase verbetert de reproduceerbaarheid en de piekvorm, waardoor de scheidingskwaliteit wordt geoptimaliseerd. Maar welke zouten zijn hiervoor bijzonder geschikt? Hoe kunnen ze op betrouwbare wijze worden opgelost in mobiele fasen met een hoog acetonitrilgehalte? En welke invloed hebben zouten op de scheiding?

Meestal worden er zouten aan de mobiele fase toegevoegd om de elektrostatische interacties tussen geladen analyten en de stationaire fase te kunnen beheersen. Dit verbetert de piekvormen van de eluerende analyten doordat er minder piekuitlopen optreden. Daarbij zijn er een aantal zaken waar rekening mee moet worden gehouden.

Geschikte zouten voor de HILIC

Normaal gesproken worden in de HILIC zouten zoals ammoniumacetaat en ammoniumformiaat gebruikt, soms ook ammoniumbicarbonaat (zie afb. 2). Interessant genoeg lossen deze zouten ook op in oplosmiddelmengsels met een hoog gehalte aan acetonitril, zoals dat bij HILIC aan het begin van de runs gebruikelijk is. Tegelijkertijd zijn deze zouten vanwege hun vluchtigheid compatibel met de daaropvolgende massaspectrometrische detectie, wat een veelgebruikte detectietechniek is voor HILIC. Het gebruik van minder goed oplosbare zouten zoals fosfaten of van ionenpaarreagentia zoals TFA moet zoveel mogelijk worden vermeden, voor zover MS-detectie wordt overwogen. Als er echter gebruik wordt gemaakt van spectroscopische detectoren, kunnen „niet-vluchtige“ zouten wel degelijk worden toegepast. Dergelijke stoffen vertonen in verhoogde mate zogenaamde uitsalz-effecten en kunnen kosmotrope en chaotrope effecten hebben op geladen moleculen, dat wil zeggen waterstofbruggen versterken of verstoren [1]. Dit zou hier echter te ver voeren en kan worden nagedaan in de publicaties van Andrew J. Alpert.

De meeste mobiele HILIC-fasen worden dus bereid door toevoeging van ammoniumacetaat of ammoniumformiaat. Beide zouten zijn niet op identieke wijze bruikbaar, aangezien ammoniumformiaat in de mobiele fase een zuurdere pH-waarde oplevert dan ammoniumacetaat.

Door beide zouten te mengen kan de pH-waarde van de mobiele fase doelgericht binnen een bepaald bereik worden ingesteld.

Invloed van het zoutgehalte

Het algemene effect van het zoutgehalte in de mobiele fase kan als volgt worden beschreven: Zouten beïnvloeden de elektrostatische interacties van geladen moleculen met geladen of zwitterionische kolommaterialen (zie HILIC-tip 3). In het geval van elektrostatische aantrekking tussen analyten en de stationaire fase geldt het volgende: een verhoging van het zoutgehalte leidt tot een verminderde retentie.

Bij elektrostatische afstoting tussen analyten en de stationaire fase geldt dus het omgekeerde: een toename van het zoutgehalte leidt tot een grotere retentie van de betreffende analyt.

Het tweede effect van het gebruik van zouten of een verhoging van het zoutgehalte in de mobiele fase komt tot uiting in de dikte van de waterlaag op het oppervlak van polaire HILIC-materialen. Het hoge gehalte aan organisch eluens in de mobiele fase aan het begin van een scheiding zorgt ervoor dat het zout zich bij voorkeur in de waterlaag ophoopt. Een toenemende zoutconcentratie leidt dus tot een toenemende dikte van de waterlaag, wat in principe gepaard gaat met een sterkere retentie van alle polaire analyten (uitzondering zie hierboven). Daarom leidt een aanzienlijk zoutgehalte ook bij polaire, niet-geladen analyten tot een verhoogde retentie, zelfs als deze geen elektrostatische interactie kunnen aangaan. Een verklarend schema hierover is te vinden in figuur 2. Het onderliggende onderzoek hebben wij al ongeveer 15 jaar geleden uitgevoerd met betrekking tot de ZIC-HILIC-fase en gepubliceerd in een artikel [2].

Bereiding van de mobiele fase

Voor een voldoende reproduceerbaarheid van retentie en piekvorm is het noodzakelijk om in de mobiele fase een eindconcentratie aan zout van ten minste 5 mmol/L te hebben en deze concentratie continu stabiel te houden. De invloeden van een zoutgradiënt hebben we elders besproken en zullen we hier buiten beschouwing laten [3]. De oplosbaarheid van de zouten in de mobiele fase met een hoog gehalte aan organische oplosmiddelen kan echter problematisch blijken te zijn en leidt vaak tot neerslag van de zouten in de oplossing.

Bij mobiele fasen met een acetonitrilgehalte van 95 % moet de zoutconcentratie, vanwege de beperkte oplosbaarheid, in eerste instantie onder de 15 mmol/L worden gehouden.

Een conventionele werkwijze voor de bereiding van mobiele fasen voor HILIC wordt weergegeven in figuur 3. Als voorbeeld wordt 1 L van een mobiele fase uit acetonitril/water (95:5, v/v) bereid met een uiteindelijke ammoniumacetaatconcentratie van 10 mmol/L. Het is daarbij van cruciaal belang dat het ammoniumacetaat eerst volledig in zuiver water wordt opgelost. Hiervoor wordt eerst 50 mL van een waterige ammoniumacetaatoplossing met een concentratie van 200 mmol/L bereid. Door eenvoudig te roeren lost het zout binnen enkele seconden volledig op in het water. Vervolgens wordt onder voortdurend roeren langzaam 950 mL acetonitril toegevoegd aan de 50 mL waterige ammoniumacetaatoplossing. Op deze manier verkrijgt men 1 L van een mobiele fase met een acetonitril/water-verhouding van 95:5 (v/v) en een uiteindelijke ammoniumacetaatconcentratie van 10 mmol/L.

De uiteindelijke oplossing kan nu op de bodem van de fles troebele kleine bolletjes vertonen. Dit duidt op een niet-perfecte oplossing van het zout in de mobiele fase. Het gebruik van doorzichtige glazen flessen kan helpen bij het in de gaten houden van dit effect. Krachtig roeren, misschien zelfs een hele nacht lang, zal de oplosbaarheid van het zout niet verbeteren. Om het zout echter volledig op te lossen, moet men de fles met de oplossing in een ultrasoonbad plaatsen totdat de oplossing helder wordt en de druppeltjes of deeltjes verdwenen zijn. Normaal gesproken is een ultrasone behandeling van 30 minuten ruimschoots voldoende.

Zodra het zout volledig is opgelost, kan de mobiele fase zoals gebruikelijk worden gefilterd en is deze vervolgens direct beschikbaar voor chromatografische toepassingen. Deze werkwijze kan ook worden toegepast op andere mobiele HILIC-fasen en indien nodig worden aangepast. Het watergehalte, het type zout en de zoutconcentratie kunnen daarbij doelgericht worden aangepast aan de betreffende toepassing. Daarnaast is een reproduceerbare ultrasone behandeling van belang. Met name de intensiteit en de duur van de ultrasone behandeling moeten altijd constant worden gehouden.

Effect van het zoutgehalte

Naast de invloed op de elektrostatische interacties beïnvloedt de zoutconcentratie ook de dikte van de waterlaag, waardoor ook de retentie van ongeladen verbindingen wordt beïnvloed. Een hoog percentage organisch oplosmiddel in het eluens zorgt ervoor dat zout bij voorkeur in de waterlaag wordt gedreven. Een verhoging van de zoutconcentratie leidt dus consequent tot een dikkere waterlaag. Dit dubbele effect van de zoutconcentratie is bij sommige scheidingen waarneembaar. Voorbeeld:

Scheiding van 2-hydroxybenzoëzuur en 4-hydroxybenzoëzuur (2-HB en 4-HB; in figuur 4 aangeduid als nr. 1 en nr. 2) op drie kolommen met verschillende eigenschappen (zoals weergegeven in figuur 4 en ontleend aan het origineel [3]). Bij een neutrale pH-waarde bevinden beide analyten zich door deprotonering van de carboxylzuurgroep in hun negatief geladen toestand. Een verhoging van de ammoniumacetaatconcentratie van 10 mM naar 15 mM bij een constant gehalte van 90% acetonitril in de mobiele fase leidt bij 4-HB tot een aanzienlijke versterking van de binding aan de neutrale diol-kolom en een langere retentietijd.

Ter informatie: 2-HB bevat een intramoleculaire waterstofbrug tussen de carboxyl- en de hydroxylgroep [5], waardoor dit molecuul zich hier chromatografisch zeer „onpolair“ gedraagt (zoals bijvoorbeeld tolueen) en dus niet wordt vertraagd op een neutrale HILIC-kolom.

Terug naar de polaire scheiding: de duidelijk verhoogde retentie bij een hoger zoutgehalte als gevolg van de dikkere waterlaag is voor 4-HB vooral bij neutrale fasen duidelijk te zien.

De invloed van de zoutconcentratie op de retentie wordt bovendien toegeschreven aan een uitsalz-effect [1]. Hierbij worden watermoleculen in grotere mate gebonden aan de solvataatvorming van de zoutionen, waardoor de solvataatvorming van de analyten afneemt en hun directe interacties met de stationaire fase kunnen worden bevorderd. In het geval van de positief geladen aminofase is een elektrostatische aantrekking met beide moleculen waarneembaar, d.w.z. met het anionische 2-HB en 4-HB (bij het laatste aanzienlijk sterker vanwege de hydrofilie). Een verhoging van de zoutconcentratie leidt tot een afname van de elektrostatische aantrekkingskracht, met als gevolg een afname van de retentie.

Zoals eerder besproken, zorgt bij zwitterionische stationaire fasen de binnenste kationische groep voor een elektrostatische aantrekking van negatief geladen analyten zoals 2-HB en 4-HB. Tegelijkertijd ondervinden deze analyten een elektrostatische afstoting door de buitenste anionische groep van de stationaire fase. Deze effecten zijn echter niet doorslaggevend, want het belangrijkste effect is hier niet de elektrostatische wisselwerking, maar vooral de toegenomen dikte van de waterlaag bij een verhoogde zoutconcentratie.

In de volgende HILIC-tip gaan we in op de gecombineerde effecten van organische stoffen en zout.

Literatuur

[1] A.J. Alpert: Effect van zouten op de retentie bij hydrofiele interactiechromatografie. Journal of Chromatography A 2018, 1538, 45-53

[2] G. Greco, S. Grosse en T. Letzel: Onderzoek naar het retentiegedrag van isomere hydroxy- en aminobenzoëzuren bij zwitterionische hydrofiele interactiechromatografie. Journal of Chromatography A 2012, 1235, 60-67.

[3] T. Letzel: Specificaties van gradiënten in hydrofiele interactie-vloeistofchromatografie (HILIC). In: Gradient HPLC for Practitioners: RP, LC-MS, ionenanalyse, biochromatografie, SFC, HILIC. Stavros Kromidas (red.) Wiley-VCH; ISBN-10: 352734408X; 1e druk (17 april 2019), blz. 175-182

[4] G. Greco en T. Letzel: Belangrijkste interacties en invloeden van de chromatografische parameters bij HILIC-scheidingen. Journal of Chromatographic Science, 2013, 51 (7), 684-693.

[5] S. Grosse en T. Letzel: Vloeistofchromatografie / massaspectrometrie met ionisatie bij atmosferische druk en vloeistofmenging na de kolom voor de efficiënte bepaling van gedeeltelijk geoxideerde polycyclische aromatische koolwaterstoffen. Journal of Chromatography A 2007, 1139, 75-83.

Naar de andere HILIC-tips

De auteurs

Dr. Thomas Letzel: Oprichter en directeur, Analytisches Forschungsinstitut für Non-Target Screening GmbH (AFIN-TS), www.afin-ts.de

Thomas Letzel volgde een opleiding tot chemisch laborant, studeerde daarna scheikunde en promoveerde op het gebied van milieuanalyse. Daarna volgden analytische onderzoeksverblijven in Amsterdam en München (aan de TUM, waar hij sinds 2009 ook als privédocent ‘Analytische chemie en bioanalytiek’ lesgeeft). Sinds 2018 doet hij onderzoek en geeft hij advies (als onderdeel van het oprichterstrio) via zijn eigen onderzoeksinstituut en heeft hij zich ten doel gesteld om HILIC als HPLC-methode meer in de dagelijkse analytische praktijk te integreren.

Dr. Stefan Bieber: Oprichter en directeur, Analytisches Forschungsinstitut für Non-Target Screening GmbH (AFIN-TS)

Samen met Thomas Letzel staat Stefan Bieber aan het hoofd van AFIN-TS GmbH als directeur en houdt hij zich al vele jaren bezig met non-target screening.


.

Dr. Annette Dibowski:Algemeen directeur, Dichrom GmbH, www.dichrom.com

Annette Dibowski is niet alleen directeur van Dichrom en salesconsultant bij Biotech Fluidics, maar ook een gepassioneerde ‘poolonderzoeker’ op het gebied van de chromatografie van polaire verbindingen.